Autofàgia: el procés desconegut de degradació cel·lular
Autor: LAIA PARAREDA DE LA OSA
Centre: INST.JAUME CALLÍS
Document:
El concepte “autofàgia” defineix un mecanisme a partir del qual la cèl·lula segresta i digereix, per mitjà de la formació de vesícules, un gran nombre de molècules diverses amb el propòsit de facilitar el seu propi desenvolupament.
Es fonamenta en la necessitat quotidiana de les cèl·lules d’eliminar o desfer-se de proteïnes, orgànuls o altres estructures que per alguna raó suposen un perill per al seu correcte funcionament, i en el procés que ha de tenir lloc a dins d’aquestes com a mètode per aconseguir uns mínims nivells d’energia en situacions d’estrès prolongades.
Sense dubte es tracta d’un tema poc conegut, però que podria esdevenir essencial per a la identificació d’algunes de les causes de diverses malalties conegudes produïdes per errors en l’operativitat natural del procediment autofàgic. Caldria, però, continuar amb la investigació d’aquest àmbit que, de moment, genera més preguntes que respostes.
Els principals objectius del projecte de recerca són:
- Comprendre el procés d’autofàgia i la seva implicació a l’hora de participar en un gran nombre de situacions metabòliques diferents.
- Investigar amb quines molècules es relaciona el procés de degradació i en quin nivell aquestes participen de l’autofàgia.
- Aprendre i entendre els procediments i tècniques de laboratori necessaris per a realitzar una part pràctica adequada, amb l’ús també de cultius cel·lulars.
- Intentar obtenir conclusions adients a un procés cel·lular complex del qual encara se saben poques coses.
- Arribar al final del treball havent fet una recerca exhaustiva sobre el tema, havent assolit tots els coneixements que aquest contingut ens pot proporcionar.
La part experimental, d’altra banda, se centra sobretot en la intenció de determinar la veracitat de la hipòtesi proposada a partir de la qual voldria estudiar la possible interacció existent entre dues proteïnes conegudes i esmentades en certes publicacions científiques per tenir funcions específiques dins del procés d’autofàgia. Aquestes proteïnes reben el nom de TBC1D15 i de Rab7. La intenció d’aquesta recerca és, per tant, aconseguir resultats adients i suficients per informar sobre la vertadera funció de les macromolècules en el cas que de certa manera es mantinguin en contacte en algun moment com a pas imprescindible de la situació autofàgica.
Al llarg del treball s’han utilitzat dues tècniques que esdevenen la base a partir de la qual és possible la interpretació de resultats. Aquestes tècniques, anomenades immunofluorescència i coimmunoprecipitació, consten de diferents fases, complimentades a partir de material específic, que pretenen arribar a una idea final, comuna i definitiva. L’aplicació d’aquests mètodes requereix la utilització de tres variables comunes per a les dues proves i la de cinc grups control presents només en la segona.
Diversos investigadors han determinat la influència de TBC1D15 com a possible desactivador de Rab7 per mitjà de la formació d’un complex dins del procés d’autofàgia com a mètode per permetre’n la seva evolució. Per comprovar si això es dona així, he pres com a variables tres tipologies de Rab7, segons si es troba en estat Wild Type (activant-se i inactivant-se contínuament), en estat sempre actiu o en estat sempre inactiu. He separat en diferents eppendorfs el material genètic que codifica per a cadascuna d’aquestes proteïnes i en cada cas l’he barrejat amb TBC1D15, amb l’objectiu d’observar si es produïa la unió realment i en conseqüència la inhabilitació de Rab7.
Després de l’anàlisi dels resultats obtinguts per mitjà de la immunofluorescència i de la coimmunoprecipitació, es pot afirmar el següent:
La immunofluorescència determina una gran proximitat entre Rab7 en estat sempre actiu i TBC1D15, indicant una possible interacció entre les proteïnes que no es pot demostrar per la poca precisió de la tècnica. Així mateix, s’observa també la proximitat entre TBC1D15 i Rab7 en estat Wild Type, però es confirma que no és possible la interacció, afirmant que entre les macromolècules es dona una única situació de veïnatge.
La coimmunoprecipitació, d’altra banda, esdevé una prova molt més precisa que l’anterior. Aquesta ens permet arribar a les mateixes deduccions que la immunofluorescència, senyalant la formació d’un complex entre TBC1D15 i Rab7, tan quan es troba en estat WT (en menor quantitat) com quan es troba en estat sempre actiu, dins del procés d’autofàgia. L’ús de tècniques com l’electroforesi o el western blot assegura la possibilitat d’assolir conclusions més definitives. Tot i així, però, la prova presenta un problema. Els grups control, que haurien servit per determinar i afirmar definitivament que el que ens avançava la immunofluorescència era verídic, no surten bé. Cal per tant tornar a realitzar rèpliques del procediment per garantir l’obtenció de grups control eficients.
En conclusió, s’estableix que sembla existir una relació evident entre TBC1D15 i Rab7 durant el procés d’autofàgia, que es podria precisar fins a senyalar la generació d’una unió de les dues proteïnes amb la intenció de desactivar la segona en mans de la primera. Degut als errors comesos durant la realització dels grups control, això segueix sent una hipòtesi, cada vegada més reafirmada en el que s’acosta ja a una investigació realitzada per fonts diferenciades.
Com ja hem dit, l’autofàgia és un tema que fins fa poc passava desapercebut. Queda un llarg camí per recórrer en el qual s’hauran d’establir nous criteris per aportar rigor, eficiència i respostes totalment satisfactòries a un procés difícil de comprendre, que ha resolt alguns dels meus dubtes però que sobretot n’ha generat de nous. El temps i les repeticions podrien ser bones solucions als conflictes generats. Ara bé, qüestionar-se no és la gran motivació del científic?
Es fonamenta en la necessitat quotidiana de les cèl·lules d’eliminar o desfer-se de proteïnes, orgànuls o altres estructures que per alguna raó suposen un perill per al seu correcte funcionament, i en el procés que ha de tenir lloc a dins d’aquestes com a mètode per aconseguir uns mínims nivells d’energia en situacions d’estrès prolongades.
Sense dubte es tracta d’un tema poc conegut, però que podria esdevenir essencial per a la identificació d’algunes de les causes de diverses malalties conegudes produïdes per errors en l’operativitat natural del procediment autofàgic. Caldria, però, continuar amb la investigació d’aquest àmbit que, de moment, genera més preguntes que respostes.
Els principals objectius del projecte de recerca són:
- Comprendre el procés d’autofàgia i la seva implicació a l’hora de participar en un gran nombre de situacions metabòliques diferents.
- Investigar amb quines molècules es relaciona el procés de degradació i en quin nivell aquestes participen de l’autofàgia.
- Aprendre i entendre els procediments i tècniques de laboratori necessaris per a realitzar una part pràctica adequada, amb l’ús també de cultius cel·lulars.
- Intentar obtenir conclusions adients a un procés cel·lular complex del qual encara se saben poques coses.
- Arribar al final del treball havent fet una recerca exhaustiva sobre el tema, havent assolit tots els coneixements que aquest contingut ens pot proporcionar.
La part experimental, d’altra banda, se centra sobretot en la intenció de determinar la veracitat de la hipòtesi proposada a partir de la qual voldria estudiar la possible interacció existent entre dues proteïnes conegudes i esmentades en certes publicacions científiques per tenir funcions específiques dins del procés d’autofàgia. Aquestes proteïnes reben el nom de TBC1D15 i de Rab7. La intenció d’aquesta recerca és, per tant, aconseguir resultats adients i suficients per informar sobre la vertadera funció de les macromolècules en el cas que de certa manera es mantinguin en contacte en algun moment com a pas imprescindible de la situació autofàgica.
Al llarg del treball s’han utilitzat dues tècniques que esdevenen la base a partir de la qual és possible la interpretació de resultats. Aquestes tècniques, anomenades immunofluorescència i coimmunoprecipitació, consten de diferents fases, complimentades a partir de material específic, que pretenen arribar a una idea final, comuna i definitiva. L’aplicació d’aquests mètodes requereix la utilització de tres variables comunes per a les dues proves i la de cinc grups control presents només en la segona.
Diversos investigadors han determinat la influència de TBC1D15 com a possible desactivador de Rab7 per mitjà de la formació d’un complex dins del procés d’autofàgia com a mètode per permetre’n la seva evolució. Per comprovar si això es dona així, he pres com a variables tres tipologies de Rab7, segons si es troba en estat Wild Type (activant-se i inactivant-se contínuament), en estat sempre actiu o en estat sempre inactiu. He separat en diferents eppendorfs el material genètic que codifica per a cadascuna d’aquestes proteïnes i en cada cas l’he barrejat amb TBC1D15, amb l’objectiu d’observar si es produïa la unió realment i en conseqüència la inhabilitació de Rab7.
Després de l’anàlisi dels resultats obtinguts per mitjà de la immunofluorescència i de la coimmunoprecipitació, es pot afirmar el següent:
La immunofluorescència determina una gran proximitat entre Rab7 en estat sempre actiu i TBC1D15, indicant una possible interacció entre les proteïnes que no es pot demostrar per la poca precisió de la tècnica. Així mateix, s’observa també la proximitat entre TBC1D15 i Rab7 en estat Wild Type, però es confirma que no és possible la interacció, afirmant que entre les macromolècules es dona una única situació de veïnatge.
La coimmunoprecipitació, d’altra banda, esdevé una prova molt més precisa que l’anterior. Aquesta ens permet arribar a les mateixes deduccions que la immunofluorescència, senyalant la formació d’un complex entre TBC1D15 i Rab7, tan quan es troba en estat WT (en menor quantitat) com quan es troba en estat sempre actiu, dins del procés d’autofàgia. L’ús de tècniques com l’electroforesi o el western blot assegura la possibilitat d’assolir conclusions més definitives. Tot i així, però, la prova presenta un problema. Els grups control, que haurien servit per determinar i afirmar definitivament que el que ens avançava la immunofluorescència era verídic, no surten bé. Cal per tant tornar a realitzar rèpliques del procediment per garantir l’obtenció de grups control eficients.
En conclusió, s’estableix que sembla existir una relació evident entre TBC1D15 i Rab7 durant el procés d’autofàgia, que es podria precisar fins a senyalar la generació d’una unió de les dues proteïnes amb la intenció de desactivar la segona en mans de la primera. Degut als errors comesos durant la realització dels grups control, això segueix sent una hipòtesi, cada vegada més reafirmada en el que s’acosta ja a una investigació realitzada per fonts diferenciades.
Com ja hem dit, l’autofàgia és un tema que fins fa poc passava desapercebut. Queda un llarg camí per recórrer en el qual s’hauran d’establir nous criteris per aportar rigor, eficiència i respostes totalment satisfactòries a un procés difícil de comprendre, que ha resolt alguns dels meus dubtes però que sobretot n’ha generat de nous. El temps i les repeticions podrien ser bones solucions als conflictes generats. Ara bé, qüestionar-se no és la gran motivació del científic?