El cultiu i l'expansió de les cèl·lules mare tumorals: les grans desconegues
Autor: Mariona Planas Puig
Centre: INST.SANTIAGO SOBREQUÉS VIDAL
Document:
Tdr Yellowstone- Concurs.pdf
(27.35 MB)
El càncer de mama triple negatiu (TNBC, triple-negative breast cancer) representa aproximadament el 20% de tots els casos de càncer de mama (BCa, breast cancer), sent el més agressiu i amb pitjor pronòstic. Actualment, a causa de la manca de dianes terapèutiques específiques d’aquest subtipus, la quimioteràpia és l’únic tractament disponible. En els últims anys s’ha assenyalat una petita població de cèl·lules tumorals amb propietats de cèl·lules mare com a principals responsables del mal pronòstic i recaigudes d’aquesta subtipus de BCa anomenades cèl·lules mare tumorals (BCSC, breast cancer stem cells). Per aquest motiu s’ha vist aquest fet com una nova diana terapèutica per desenvolupar nous agents dirigits a TNBC i especialment a l’eliminació de les BCSC.
Tradicionalment, s’ha utilitzat el cultiu en dues dimensions (2D) per cultivar cèl·lules, és a dir, superfícies de poliestirè conegudes com a plaques de Petri. Aquestes plaques permeten que les cèl·lules creixin i es divideixin exponencialment. No obstant això, aquest sistema de cultiu no mimetitza correctament el microambient tumoral. En aquests últims anys diferents grups de recerca han començat a créixer i cultivar cèl·lules en tres dimensions (3D) amb l’objectiu d’aconseguir un cultiu més similar al present en el teixit mamari. En el present treball es pretén generar i cultivar cèl·lules en unes estructures en 3D (scaffolds) amb l’objectiu d’enriquir, expandir i caracteritzar la subpoblació de BCSCs en mostres cel·lulars de TNBC i així doncs, facilitarà el desenvolupament i l’estudi de teràpies dirigides contra aquest subtipus de càncer. Es vol comprovar l'hipòtesi següent : "el medi de cultiu cel·lular en tres dimensions (3D) permet un enriquiment de la subpoblació de cèl·lules mare tumorals en comparació amb els cultius tradicionals en dues dimensions (2D)".
Per poder dur a terme l'experimentació necessària vaig assistir al laboratori del grup de recerca TragetsLab de la Universitat de Girona. Primerament, vaig imprimir amb una impressora 3D els scaffolds / bastides (medi de cultiu 3D). Seguidament vaig utilitzar aquests scaffols per comparar la capacitat de proliferació d’una línia cel·lular de TNBC (línia cel·lular: MDA-MB-468) cultivada en 2D i en 3D (scaffolds). Posteriorment, vaig avaluar l’enriquiment de la població de BCSCs cultivades en scaffolds mitjançant l’anàlisi de l’expressió de gens específics de la població de BCSC: CD24, CD44, ALDHL en comparació amb un gen control (GAPDH), per poder determinar l’enriquiment o no de la subpoblació de les cèl·lules mare tumorals.
Des del punt de vista sostenible hem tingut en compte que els scaffolds estan fets del biopolímer Polye-caprolactone (PCL). Aquest material és biocompatible i biodegradable. La seva finalitat és que més endavant siguin acceptats pel nostre teixit sense causar rebuig immunitari, degradant-se al interior. Econòmicament aquestes bastides són polímers econòmicament assequibles per si en un futur s'haguessin de fabricar a major escala.
El resultat de la MTT va mostrar que hi ha més proliferació cel·lular en el cultiu 2D que en el 3D. En els medis de cultiu 2D les cèl·lules estan molt més en contacte una de l’altre i fàcilment es desenvolupen i proliferen. En canvi, en els cultius 3D els scaffolds les cèl·lules es troben més distants unes de les altres fet que provoca que no hi hagi tant contacte cèl·lula-cèl·lula i per tant, no s’alliberin uns factors que activen més la proliferació cel·lular. Tot i això, poden haver-hi un alt percentatge de cèl·lules mare tumorals en els cultius 3D; en canvi, ens els 2D el percentatge podria ser més baix o quasi nul.
Per altra banda, els resultats obtinguts en quan a l’expressió génica mostren un clar augment de l’expressió del gen CD44 en el cultiu en 3D respecte les cultivades tradicionalment. En canvi, el gen CD24 mostra una disminució de la seva expressió en cultiu 3D. Aquest era el patró esperat. Pel que fa l’ALDH, que codifica un enzim, vam observar una disminució de l’expressió en 3D comparat amb 2D. La tècnica Real- time PCR ens permet analitzar els nivells d'expressió (RNA missatger) dels gens, però no la seva activitat, per això hauríem de fer un anàlisi de l’activitat enzimàtica.
Una vegada vaig interpretar els resultats vaig arribar a les següents conclusions: Els scaffolds de nanofibres de PCL extruïdes a l’atzar presenten característiques similars a les condicions in vivo de les cèl·lules del cos humà, és a dir la matriu extracel·lular; i el material PCL i la seva distribució permeten a les cèl·lules proliferar i desenvolupar-se similarment a l’organisme. Les cèl·lules mare tumorals necessiten ser cultivades en cultius que no difereixin del seu estat in vivo perquè no pateixin una diferenciació i perdin les qualitats de cèl·lules mare. Per últim, vam comprovar que el cultiu cel·lular en 3D mitjançant scaffolds enriqueix la població de BCSCs en comparació al cultiu en 2D.
Tradicionalment, s’ha utilitzat el cultiu en dues dimensions (2D) per cultivar cèl·lules, és a dir, superfícies de poliestirè conegudes com a plaques de Petri. Aquestes plaques permeten que les cèl·lules creixin i es divideixin exponencialment. No obstant això, aquest sistema de cultiu no mimetitza correctament el microambient tumoral. En aquests últims anys diferents grups de recerca han començat a créixer i cultivar cèl·lules en tres dimensions (3D) amb l’objectiu d’aconseguir un cultiu més similar al present en el teixit mamari. En el present treball es pretén generar i cultivar cèl·lules en unes estructures en 3D (scaffolds) amb l’objectiu d’enriquir, expandir i caracteritzar la subpoblació de BCSCs en mostres cel·lulars de TNBC i així doncs, facilitarà el desenvolupament i l’estudi de teràpies dirigides contra aquest subtipus de càncer. Es vol comprovar l'hipòtesi següent : "el medi de cultiu cel·lular en tres dimensions (3D) permet un enriquiment de la subpoblació de cèl·lules mare tumorals en comparació amb els cultius tradicionals en dues dimensions (2D)".
Per poder dur a terme l'experimentació necessària vaig assistir al laboratori del grup de recerca TragetsLab de la Universitat de Girona. Primerament, vaig imprimir amb una impressora 3D els scaffolds / bastides (medi de cultiu 3D). Seguidament vaig utilitzar aquests scaffols per comparar la capacitat de proliferació d’una línia cel·lular de TNBC (línia cel·lular: MDA-MB-468) cultivada en 2D i en 3D (scaffolds). Posteriorment, vaig avaluar l’enriquiment de la població de BCSCs cultivades en scaffolds mitjançant l’anàlisi de l’expressió de gens específics de la població de BCSC: CD24, CD44, ALDHL en comparació amb un gen control (GAPDH), per poder determinar l’enriquiment o no de la subpoblació de les cèl·lules mare tumorals.
Des del punt de vista sostenible hem tingut en compte que els scaffolds estan fets del biopolímer Polye-caprolactone (PCL). Aquest material és biocompatible i biodegradable. La seva finalitat és que més endavant siguin acceptats pel nostre teixit sense causar rebuig immunitari, degradant-se al interior. Econòmicament aquestes bastides són polímers econòmicament assequibles per si en un futur s'haguessin de fabricar a major escala.
El resultat de la MTT va mostrar que hi ha més proliferació cel·lular en el cultiu 2D que en el 3D. En els medis de cultiu 2D les cèl·lules estan molt més en contacte una de l’altre i fàcilment es desenvolupen i proliferen. En canvi, en els cultius 3D els scaffolds les cèl·lules es troben més distants unes de les altres fet que provoca que no hi hagi tant contacte cèl·lula-cèl·lula i per tant, no s’alliberin uns factors que activen més la proliferació cel·lular. Tot i això, poden haver-hi un alt percentatge de cèl·lules mare tumorals en els cultius 3D; en canvi, ens els 2D el percentatge podria ser més baix o quasi nul.
Per altra banda, els resultats obtinguts en quan a l’expressió génica mostren un clar augment de l’expressió del gen CD44 en el cultiu en 3D respecte les cultivades tradicionalment. En canvi, el gen CD24 mostra una disminució de la seva expressió en cultiu 3D. Aquest era el patró esperat. Pel que fa l’ALDH, que codifica un enzim, vam observar una disminució de l’expressió en 3D comparat amb 2D. La tècnica Real- time PCR ens permet analitzar els nivells d'expressió (RNA missatger) dels gens, però no la seva activitat, per això hauríem de fer un anàlisi de l’activitat enzimàtica.
Una vegada vaig interpretar els resultats vaig arribar a les següents conclusions: Els scaffolds de nanofibres de PCL extruïdes a l’atzar presenten característiques similars a les condicions in vivo de les cèl·lules del cos humà, és a dir la matriu extracel·lular; i el material PCL i la seva distribució permeten a les cèl·lules proliferar i desenvolupar-se similarment a l’organisme. Les cèl·lules mare tumorals necessiten ser cultivades en cultius que no difereixin del seu estat in vivo perquè no pateixin una diferenciació i perdin les qualitats de cèl·lules mare. Per últim, vam comprovar que el cultiu cel·lular en 3D mitjançant scaffolds enriqueix la població de BCSCs en comparació al cultiu en 2D.